一、CRISPR Screen简介
CRISPR Screen是一种利用CRISPR-Cas9系统进行基因组规模基因功能筛选的高通量技术。其核心在于通过合成特异性sgRNA（单导向RNA），引导Cas9核酸酶在基因组中进行特定位点的DNA切割，导致基因的敲除或功能丧失。成千上万的sgRNA被精确设计用于靶向不同的基因，并通过病毒载体将这些sgRNA文库引入目标细胞内，完成大规模基因编辑。
在经过一系列筛选步骤后，例如药物处理或环境应激，未被编辑或对筛选条件不敏感的细胞会逐渐减少。随后，通过二代测序（NGS）技术对存活细胞的基因组进行测序分析，可以精确检测到各个sgRNA在细胞群体中的丰度变化。通过计算这些丰度的变化，科研人员能够识别出在特定生物过程或筛选条件下至关重要的基因，并进行深入的功能解析。这一过程不仅能够揭示基因的生物学功能，还能帮助发现潜在的药物靶点和关键调控基因。
二、CRISPR-Screen 文库筛选流程
🔹 阶段1： 文库构建——涉及文库中所有基因的sgRNA设计， sgRNA模板合成， sgRNA连接到特定的质粒模板构建文库质粒以及对构建成功的文库质粒进行二代测序文库质检（覆盖度、均一性等）。
🔸 阶段2：文库转导——大部分文库筛选实验都是通过慢病毒感染方法进行文库转导，所以该阶段涉及到文库慢病毒包装，包装好的文库病毒液以低MOI感染目的细胞，并根据文库病毒中的抗性进行阳性感染细胞筛选。
🔹 阶段3：细胞筛选——该阶段就是根据实验目的，选择合适的筛选压力/药物对细胞进行筛选，获得不同筛选条件的细胞进行后续的数据分析。
🔸 阶段4：文库测序——该阶段就是对筛选各组的细胞，提取基因组DNA后，对细胞群体内的sgRNA序列进行特异性PCR和NGS测序。
🔹 阶段5:生信分析——通过对比筛选组别之间的sgRNA种类，丰度变化，从而鉴定出一系列与筛选条件有关的候选基因。
三、二代测序（NGS）在CRISPR screen中的应用
NGS作为一种高通量测序技术，能够快速、准确地测定大量DNA片段的序列信息。在CRISPR screen中，NGS主要用于以下两个方面：
（1）sgRNA库的质检：在实验开始前，利用NGS对sgRNA库进行质控，确保文库中的每个sgRNA都得到充分代表，并且文库的多样性符合预期。
（2）筛选结果的分析：在经过筛选步骤后，通过NGS测序来检测筛选后的细胞群体中，每个sgRNA的丰度变化，从而确定哪些基因被正向或负向选择。
⚫ sgRNA库的质控与验证
在CRISPR screen实验的初期，sgRNA库的质量直接决定了实验结果的可靠性。我们利用NGS技术对sgRNA库进行全面质控，以确保其多样性和均一性，为后续实验提供坚实的数据基础。
（1）测序数据质量评估：通过NGS，我们首先评估测序数据的质量，包括Clean Q20与Clean Q30的比例，这些指标反映了碱基测序错误率的低下与测序数据的高质量，确保了后续分析的准确性。
（2）sgRNA序列比对与覆盖度分析：测序数据中的sgRNA序列通过比对软件与参考sgRNA文库序列进行比对，生成比对率（Mapping ratio）和覆盖度（Coverage ratio）等关键指标。高比对率和接近100%的覆盖度表明文库中的大多数sgRNA都得到了充分检测，文库质量得到保障。
（3）基尼系数与Skew Ratio分析：基尼系数用于评估sgRNA在文库中的均一性，Skew Ratio则帮助评估文库的均一性，确保在筛选实验中避免假阳性或假阴性结果的产生。这些数据为CRISPR screen的成功提供了可靠保障。用于评估测到的sgRNAreads数平均程度。基尼指数值为0：代表完全平均，即每个 sgRNA的reads数都相同。基尼指数值介于 0 和 0.3 之间：表示高度平均；基尼指数值在 0.3 和 0.4 之间：表示中等程度的平均；基尼指数值介于 0.4 和 0.5 之间：表明平均程度较低。基尼指数值高 0.5：表明平等程度很低。
⚫ 筛选后细胞群体的测序分析
（1）在CRISPR screen实验完成筛选步骤后，筛选后的细胞群体需要通过NGS进行测序分析，以确定在特定条件下受到正向或负向选择的基因。通过比对和统计分析，生成筛选基因的RRA score、Log2FC、P value等重要参数，帮助客户识别实验中显著变化的关键基因。
（2）高深度测序与精确比对：200x以上高测序深度确保每个sgRNA都得到充分覆盖。通过精确的比对和数据分析，我们能够精确识别在实验条件下受到选择性压力影响的基因，确保筛选结果的高精度和可靠性。
（3）数据可视化与结果解读：筛选结果通过火山图、散点图等可视化方式展示，直观地显示正向和负向筛选的基因，为客户提供明确的实验结果，便于进一步的科学研究或商业应用。
四、文库建库要求
在CRISPR筛选建库实验中，为了确保每个sgRNA在筛选过程中得到充分代表并产生可靠的结果，我们需要保证sgRNA在建库过程的多样性和覆盖度。
（1）多样性和覆盖度的重要性
多样性：指文库中所有不同sgRNA的种类数量。在CRISPR筛选中，保持sgRNA的多样性非常重要，因为每一个sgRNA代表了一个基因敲除的可能性。如果多样性降低（即某些sgRNA在PCR扩增过程中未能有效扩增），可能导致对某些基因敲除的评价失准。
覆盖度：指每个sgRNA在PCR扩增后是否能够以足够的频次出现在测序文库中。这意味着要确保每个sgRNA都有足够的拷贝数进行后续的测序，以便能在测序中检测到。
为了达到足够的覆盖度，推荐10 ug DNA/2500条sgRNA投入到100ul扩增体系中，可以确保每个sgRNA在PCR扩增开始时有足够的模板拷贝数。这有助于在扩增过程中保持文库的多样性，即确保所有不同的sgRNA序列都能够被有效扩增。
（2）PCR扩增中的偏差
在进行PCR扩增时，不同的sgRNA可能由于扩增效率不同而出现扩增偏差。这些偏差可能导致某些sgRNA过度扩增，而另一些则未能得到足够的扩增，最终影响测序的代表性。为了减少这些扩增偏差的影响，文中建议针对文库中的每2,500个sgRNA进行一次100 μL的PCR反应。例如，对于一个包含25,000个sgRNA的定制文库，至少需要进行10次100 μL的PCR反应。
（3）高深度数据量测序
在CRISPR筛选实验中，为了确保每个sgRNA都有足够的测序深度，从而在测序数据中被可靠地检测到，测序推荐至少200x覆盖深度。
五、我们的服务内容及优势
（1）高细胞密度样本的DNA提取
我们专注于从高细胞密度样本中提取高质量的基因组DNA，适用于各种细胞类型，包括哺乳动物细胞、肿瘤细胞等。
（2）对sgRNA区域进行特异性引物设计，扩增富集
（3）数据分析与报告
我们不仅提供高质量的数据，还为您提供详尽的分析报告，帮助您深入解读实验结果，做出科学决策。
🔹 标准化数据处理：所有测序数据都经过严格的标准化处理，确保结果的一致性和准确性。
🔹 定制化数据分析：我们根据您的研究需求，提供定制化的数据分析服务，包括基因表达分析、突变检测、基因型分型等。
🔹 结果可视化：我们提供丰富的结果可视化选项，包括火山图、热图、散点图等，帮助您直观理解分析结果。
（4）实验设计与技术支持
我们经验丰富的技术团队可以为您的实验提供全面的设计和技术支持，确保实验的成功。
🔹 实验方案设计：我们有CRISPR screen全流程文库筛选到二代测序的经验，提供从sgRNA文库设计、oligo合成、质粒文库构建、病毒包装感染到细胞筛选（链接对应的文库筛选推文）、文库扩增子测序一站式服务，根据您的研究目标，帮助设计最佳的实验方案。
🔹 技术咨询：我们的专家团队随时为您提供技术支持和咨询，解决实验过程中遇到的各种问题，确保实验的顺利进行。
珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。